Bildgebende Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie
Die Abklingzeit eines elektronisch angeregten Fluorophor liegt typischerweise im Bereich einiger Nanosekunden. In der Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung wird der exponentielle Zerfall einer Probe ermittelt, wobei eine Zeitauflösung im Pikosekundenbereich erforderlich ist. Unser anspruchsvolles TDC und ADC Lösungen meistern diesen Job mit Bravour.
Die Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) ist ein sehr schonendes, bildgebendes Verfahren der Mikroskopie, bei welchem die Probe mit einem kurzen Lichtpuls angeregt und die exponentielle Abklingrate der Fluoreszenz gemessen wird. Die geringe Intensität des Lichtpulses gehört zu den großen Vorteilen der FLIM-Methode, welche somit zu den minimal-invasiven Untersuchungsmethoden gezählt werden kann. Sie beruht auf der Messung der unterschiedlichen Lebensdauern der angeregten Zustände fluoreszierender Moleküle, die typischerweise nur wenige Nanosekunden betragen. Da die jeweilige Floreszenzlebensdauer stark von den Bedingungen in der Mikroumgebung dieser Moleküle oder von der Nähe anderer fluoreszierender Moleküle abhängt, können mittels dieses Bildgebungsverfahrens sowohl strukturelle als auch funktionelle Informationen zu diesen Umgebungsbedingungen gewonnen werden.
Wie der Name schon ahnen lässt, ist die Lebenszeit der Fluoreszenz (fluorescence lifetime) die zentrale Auswertegröße bei FLIM-Messungen. Diese Abklingungszeit beschreibt, wie lange ein Molekül im angeregten Zustand verbleibt und dabei Photonen emittiert. Darüberhinaus lässt FLIM auch Rückschlüsse auf die Intensität (fluorescence intensity) zu, die sich aus der Anzahl der pro Zeiteinheit abgegebenen Photonen in einem bestimmten Wellenlängenbereich ergibt. FLIM ist eine Form der photonenzählenden Bildgebung und heute eine gut etablierte Bildgebungstechnik, bei der ein Bild aus einzelnen Photonen-Emissionen zusammengesetzt wird, deren Position während des Detektionsprozesses aufgezeichnet wird. Das Ergebnis der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie sind also Bilder von der Probe, in denen jedes Bildpixel die Fluoreszenzlebensdauer in Bezug auf seine entsprechende Position repräsentiert.
Die Entwicklung konfokaler Laser-Scanning-Mikroskope ermöglichte erstmals FLIM auf Basis von TCSPC (Zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung) und eröffnete damit neue Anwendungen in der biologischen Forschung. FLIM findet seither eine zunehmende Verbreitung in vielen wissenschaftlichen Disziplinen, insbesondere auch in der biologischen und medizinischen Forschung. Wie an späterer Stelle in diesem Artikel beschrieben, kann heute mittels FLIM die zelluläre Mikroumgebung einschließlich der Interaktion zwischen Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung dargestellt und überwacht werden.
Verschiedenste FLIM-Methoden befinden sich aktuell in einem starken Entwicklungsprozess, der gerade auch hinsichtlich der Datenerfassung immer wieder neue Innovationen hervorbringt. Daher beschränken wir uns hier auf eine Einführung in diese Messmethode und erheben keinerlei Anspruch auf Vollständigkeit.
Anwendungen
Neben Anwendungen in der Chemie und der Materialforschung wird FRET vornehmlich in der molekularen Biophysik, also zum Studium Biologischer Prozesse und Materialien eingesetzt. Gerade auch die medizinischen Forschung profitiert von den immer weiter verbesserten Darstellungsmöglichkeiten auf molekularer Ebene. So ist mit FLIM die räumliche Darstellung der Samples hinsichtlich von pH Wert, Viskosität, Hydrophobie und Temperatur möglich. Es können z.B. Rückschlüsse auf die Größe eines Proteins, der Bindung von Enzymen bzw. Substraten gewonnen werden. FLIM kann als Bildgebungstechnik in der konfokalen Mikroskopie, der Zwei-Photonen-Anregungsmikroskopie und der Multiphotonen-Tomographie verwendet werden. Mittels der Kombination von FLIM mit Förster-Resonanzenergietransfer (FLIM-FRET) lässt sich zudem der Faltungszustand von Proteinen darstellen.
Um komplexe multiexponentielle Zerfälle zu messen oder subtile Veränderungen in lebenden Proben zu erkennen, ist ein schnelles Timing der Photonenankunft unerlässlich.
Bevor wir uns näher mit dem Prinzip der Messmethode befassen, wollen wir uns zunächst das Ergebnis einer repräsentativen FLIM-Messung ansehen:
Die punktweise Rasterung des Präparats kann beispielsweise erreicht werden, indem der Laserstrahl mit einem Paar galvanometrischer Scanner (XY-Scanner) waagrecht und senkrecht abgelenkt wird: Der Strahl wird dann mittels eines Objektivs auf den Anregungspunkt im Präparat fokussiert. Wenn ein dreidimensionales Bild aufgenommen werden soll, werden dazu Bilder in verschiedenen Fokusebenen nacheinander erstellt. Dabei kann entweder das Präparat oder das Objektiv in der Höhe verschoben werden. Hinweis: Diese Scanner besitzen eine begrenzte Geschwindigkeit, da das exakte Fokussieren der einzelne Punkte eine gewisse Zeit erfordert.
Die konfokale Anregungslochblende
Die entscheidende Besonderheit eines CLSM gegenüber einem konventionellen Lichtmikroskop ist eine konfokale Blende (pinhole). Denn der Detektor erfasst ausschließlich Lichtanteile, welche diese Blende passiert haben. Der Durchmesser der Blende ist variabel und legt fest, in wie stark das Anregungslicht von Objektpunkten außerhalb der Fokusebene ausgeblendet wird. Die ausgeblendeten Bereiche erzeugen somit keine Fluoreszenz, folglich ist die Zahl der Photonen, die den Detektor erreicht, nicht nur von der Fluoreszenzausbeute, sondern auch vom Durchmesser der konfokalen Blende abhängig. Die konfokale Blende muss stets eine gewisse Mindestöffnung haben, damit je nach Intensität der Fluoreszenz ein Mindestmaß an Strahlung zum Detektor gelangen kann. Der gewählte Durchmesser ist in der Regel ein Kompromiss zwischen dem Rauschen (abhängig von der Intensität des Anregungslichtes) und der Auflösung bzw. Tiefendiskriminierung.
Hinweis: In modernen CLSM wird die Anregungslochblende durch die Einkopplung des Anregungslasers über Glasfasern ersetzt. Der kleine lichtführende Faserkern weist ähnliche optisch beschränkende Eigenschaften auf, wie die Blende. Auf diese Weise kann der Scanning-Prozess deutlich verkürzt werden.
Die Pulsrate des Anregungslichtes wird beim Scannen mit einem Punktdetektor grundsätzlich durch die zu messende Fluoreszenzlebensdauer begrenzt. Denn die Probe benötigt vor einem neuen Anregungspuls Zeit, in den Grundzustand abzuklingen, sodass Photonenstapelungen vermieden werden. Daher wird die Detektionsrate in der Regel auf 1% der Anregungswiederholungsrate beim hellsten Pixel begrenzt.
Als Detektoren kommen bei CLSM vornehmlich PMTs, SPADs, oder Hybrid Detektoren zum Einsatz, denn die Anforderungen an die ihre Empfindlichkeit, die Reproduzierbarkeit der Zeitmessungen, an die Quanteneffizienz und die Photonenzählfähigkeit sind besonders hoch. Ein hohes zeitliches Auflösungsvermögen, niedrige Dunkelziffern und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis sind von den Detektoren genauso gefordert, wie von der Elektronik im Bereich der Datenakquise.
CLSM bietet einige Vorteile gegenüber dem Weitfeld FLIM. Neben der Möglichkeit der dreidimensionalen Bildgebung ist die Messmethode immer dann vorteilhaft, wenn z.B. besonders dicke Präparate (wie z.B. biologische Zellen in ihrem Gewebeverbund) untersucht werden. CLSM liefert optische Schnitte, reduzierte Hintergrundunschärfe und reduziertes Photobleaching außerhalb des Brennpunkts. Auch die Kombination mit spektraler Detektion oder Polarisation ist relativ einfach. Die Out-of-Focus-Unterdrückungsmethoden der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskope ermöglichen einen höheren Kontrast und eine höhere räumliche Auflösung als Weitfeld-Flim-Systeme.
Weitfeld FLIM
Weitfeld-Fluoreszenz-Lebensdauermessungen sind insbesondere für die schnelle 2D-Lebensdauer-Kontrastbildgebung und die Bestimmung der Homogenität der Probe nützlich. Bei dieser Messmethode entsteht das Bild für alle Objektorte gleichzeitig, indem die gesamte Probe mit einem kollimierten Anregungsstrahl beleuchtet wird, um die Fluoreszenz anzuregen. Dabei werden für die Berechnung der Abklingzeiten Photonen aus dem gesamten Sichtfeld parallel von positionsabbildenden Detektoren gesammelt. Weitfeld-FLIM wird daher gern zur schnellen Abbildung großer Probenbereiche verwendet.
Für Weitfeld-FLIM können Time Domain Techniken wie z.B. TCSPC verwendet werden, wobei eine Abfolge von Fluoreszenzbildern durch Verschiebung eines Zeitfensters in der Größenordnung von Nanosekunden aufgenommen werden, die den Emissionszerfall erfassen. Alternativ kann auf Frequenzbereichsmethoden zurückgegriffen werden, bei denen das jeweiliege Fluoreszenzsignal von der Anregungsfrequenz demoduliert wird.
Als Detektoren werden bei Weitfeld-FLIM typischerweise Mikrokanalplatten (MCP-Detektoren) verwendet. In Einzelfällen kommen Detkore zum Einsatz die auf Single-Photon-Avalanche-Dioden-Arrays (SPADs) bzw. ICCD Kameras basieren. In Einzelfällen kommen auch Detektoren auf Basis von supraleitender Detektortechnologie zum Einsatz.
Weitfeld-FLIM hat im Vergleich zu CLSM den Vorteil höherer Bildraten, womit sich das Verfahren auch für grobe, automatisierte Probenuntersuchungen eignen kann. Die Empfindlichkeit und das Signal Rausch-Verhältnis der bei CLSM verwendeten Detektoren wird jedoch von den kamerabasierten Detektoren nicht erreicht. Dies führt zu einer schlechteren axialen Auflösung. Dazu kommt es in Folge von Lichtstreuung dazu, dass jedes Kamerapixel gleichzeitig gestreutes Licht von allen anderen Pixeln des beleuchteten Bereichs detektiert. Aus diesem Grund werden bei Weitfeld-FLIM die zeitlichen und räumlichen Koordinaten vermischt.
Datenerfassung und Qualität der Bildgebung
Da cronologic Produkte insbesondere für die hochauflösenden FLIM-Einzelpunktmessungen in der Time-Domain relevant sind, möchten wir uns an dieser Stelle auf die TCSPC-Datenakquise beschränken. Die Qualität der Bildgebung bei solchen Einzelpunktmessungen hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, wobei bildlich gesprochen das schwächste Glied der Kette das Ergebnis bestimmt. Einige dieser „Kettenglieder“ möchten wir im Folgenden beschreiben.
Die spezifischen Anforderungen an die Detektoren und die Datenakquise bei FLIM-Anwendungen hängen je nach Einsatzgebiet von unterschiedlichen Faktoren ab. Da die Darstellung auf dem Bildschirm durch pixelweises Ausgeben der Bilddaten aus dem digitalen Bildspeicher erfolgt, ist die Pixelgröße selbstverständlich einer der wichtigsten Faktoren. Bei der konfokalen LSM wird diese durch das Zusammenspiel der konfokalen Blende (Pinhole) und der darauf angepassten Digitalisierung der Objektinformation bestimmt. Der gewählte Zoomfaktor wirkt sich sowohl auf die Gesamtvergrößerung als auch auch die Auflösungseigenschaften des Systems aus.
Auch die Dosierung und Taktung des Anregungslichtes, inklusive der Reduzierung von Laserrauschen bzw. Schrotrauschen, ist dabei ein entscheidender Faktor. Die Eigenschaften des Anregungslichtes selbst werden dabei nicht nur auf die Probe angepasst, sondern müssen zudem an die Zeitauflösung auf der Seite des Detektors sowie der Elektronik und die Übertragungsraten bei der Datenerfassung abgestimmt werden.
Wie oben bereits erwähnt wird für jedes Bildpixel die Ankunftszeit eines Photons am Detektor in Bezug auf eine Referenz erfasst. Typischerweise ist diese Referenz der Anregungslaserpuls. Es folgt eine Erfassung der gemessenen Zeitdifferenzen zum Aufbau eines Histogramms. Dabei wird den Photonen in der Regel ein „Time Bin“ zugeordnet. Die Größe dieses Zeitfensters bestimmt letztlich, wie deutlich das angegebenen Bild den Abfall der Fluoreszenz in diesem Pixel repräsentiert. Somit ist insbesondere auch die Art der verwendeten A/D-Wandlung ein immanenter Faktor für die Qualität des abgetasteten Bildes. Dabei spielen deshalb die schnellen und effizienten Datenerfassungskonzepte moderner TDCs (Time to Digital Converter), welche die Ankunftszeit der Zeitsignale direkt in digitale Zeitstempel umwandeln, ihre Vorteile bezüglich kurzer Totzeiten und niedrigem Rauschen voll aus.
Nachtrag: FRET-Anwendungen
Im Zuge unseres kleinen Einblickes zur Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie möchten wir nicht versäumen, eine wichtige Anwendung dieses Verfahrens zu erwähnen: Die Messung eines physikalischen Prozesses der Energieübertragung, dem sogenannten Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET).
In der Proteinbiochemie und darauf basierend auch in der Zellbiologie und der Pharmakologie wird der Förster-Resonanzenergietransfer analysiert, um Protein-Protein-Interaktionen und die Wechselwirkung von Proteinen mit anderen Stoffen in Echtzeit mit einer zeitlichen Auflösung im Millisekundenbereich nachzuweisen. So können z.B. Proteinkomplexe, DNA-bindende Proteine und Enzym-Substrat-Interaktionen untersucht werden. Das Prinzip dieser Messungen basiert darauf, Moleküle oder Molekülbestandteile mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren, die jeweils an unterschiedliche Strukturen binden.
Dabei wird die Energie von einem angeregten Farbstoff (Donor) auf einen zweiten Farbstoff (Akzeptor) strahlungsfrei, also ohne das Aussenden von Photonen, übertragen. Das Anregungslicht regt ausschließlich Elektronen des Donors an, wobei diese beim Zurückfallen auf ihr ursprüngliches Niveau die Energie nicht als Fluoreszenz abgeben, sondern diese auf den Akzeptor übertragen. Dieser Energietransfer regt hingegen Elektronen des Akeptors an, worauf dieser die aufgenommene Energie nun als Fluoreszenz abgibt.
Die Energieübertragung zwischen Donor und Akzeptor findet allerdings ausschließlich dann statt, wenn der Abstand zwischen Donor und Akzeptor weniger als 5 nm beträgt. Führt eine Interaktion der markierten Moleküle zu einer räumlichen Annäherung unter diesem Abstand, so führt diese Annäherung zu einer akzeptorseitigen Fluoreszenz. Dabei wird vorausgesetzt, dass Donor und Akzeptor unterschiedliche Absorptionsspektren besitzen und dass das Emissionsspektrum des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappt. FLIM-basierte FRET-Messungen sind vergleichsweise unempfindlich gegenüber der Konzentration von Fluorophoren.
Ebenfalls zu empfehlen:
- Die Sonderausgabe FLIM - From Fundamentals to Applications in der Zeitschrift “Methods and Applications in Fluorescence”.
- Der FLIM Artikel Basic concepts and some recent developments auf Science Direct
Bildquelle
FLIM-Messbeispiel: Entnommen aus PLOS ONE Collection mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Klaus Suhling
Autor: Uwe Thomaschky
Bemerkung:
Dieser Artikel über FLIM-Anwendungen für unsere Produkte wurde von Dr. Lisa Hirvonen und Prof. Klaus Suhlings Artikel in Frontiers in Physics inspiriert, die uns freundlicherweise die Erlaubnis erteilt haben, das gezeigte Bildmaterial zu verwenden. Wir möchten Besuchern unserer Website, die sich für solche Themen interessieren, einen kleinen Einblick geben. Wir selbst beschäftigen uns in erster Linie mit den Anforderungen unserer Kunden an die Datenerfassung und sind keine Chemiker, Biologen oder Ärzte und bauen auch keine Massenspektrometer oder Bildgebungssysteme. Der folgende Inhalt ist jedoch nicht als wissenschaftliche Abhandlung zu verstehen, sondern spiegelt auch subjektive Eindrücke wider.